PCR (nghiên cứu) - ứng dụng. Kỹ thuật PCR là gì?

PCR là một xét nghiệm đã được sử dụng để chẩn đoán nhiều bệnh. Phương pháp PCR cho phép hiển thị sự hiện diện trực tiếp của vi khuẩn trong sinh vật, và cụ thể là DNA của nó. Thử nghiệm PCR được sử dụng, trong số những phương pháp khác trong chẩn đoán bệnh Lyme. Kỹ thuật PCR là gì? PCR thời gian thực là gì?

Mục lục:

1. PCR (xét nghiệm) - kỹ thuật PCR là gì?
2. PCR (nghiên cứu) - ứng dụng của phương pháp PCR
3. PCR (nghiên cứu) - Bệnh Lyme
4. PCR (nghiên cứu) - kết quả. Chúng có thể là dương tính giả không?
5. PCR (nghiên cứu) - kết quả. Chúng có thể là âm tính giả

PCR (phản ứng chuỗi polymerase) là phương pháp cơ bản được sử dụng trong các phòng thí nghiệm di truyền và phân tử. Nó được phát triển vào năm 1983 bởi Kara Mullis, người đã được trao giải Nobel năm 1993 cho nó.

Hãy nghe tất cả về kỹ thuật xét nghiệm PCR. Đây là tài liệu từ chu trình NGHE TỐT. Podcast với các mẹo.

Để xem video này, vui lòng bật JavaScript và xem xét nâng cấp lên trình duyệt web hỗ trợ video

PCR (xét nghiệm) - kỹ thuật PCR là gì?

Thử nghiệm PCR bao gồm nhiều lần khuếch đại (thường trong 30 - 40 chu kỳ) của một đoạn DNA cụ thể, ví dụ như các gen mã hóa protein Borrelia, với việc sử dụng enzyme polymerase.

Sau đó, thuốc nhuộm phân tử đặc biệt được sử dụng để làm cho đoạn DNA khuếch đại có thể nhìn thấy được. PCR, do sự khuếch đại của các đoạn DNA cụ thể, là một phương pháp siêu nhạy.

Trong phương pháp PCR, các đoạn DNA được khuếch đại với các cặp mồi cụ thể cho một vùng nhất định của DNA vi khuẩn. Ví dụ, các vùng đích trong PCR được sử dụng trong chẩn đoán bệnh Lyme là các gen mã hóa protein, ví dụ: 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Vật liệu sinh học mà xét nghiệm có thể được thực hiện là:

• máu
• một phần da từ một ban đỏ di cư
• dịch não tủy
• chất lỏng hoạt dịch hoặc từ sụn khớp
• nước tiểu

PCR (nghiên cứu) - ứng dụng của phương pháp PCR

Ngoài việc chẩn đoán Lyme borreliosis bằng phương pháp PCR, có thể phát hiện các đoạn DNA cụ thể của các vi sinh vật khác hoặc con người. Do đó, phương pháp PCR cũng được sử dụng trong:

• chẩn đoán và theo dõi các bệnh nhiễm trùng do virus: virus herpes (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovirus), HIV, virus viêm gan (HBV và HCV)
• chẩn đoán và theo dõi các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, đặc biệt là những vi khuẩn không thể xác định được qua nuôi cấy, ví dụ: bệnh lao
• chẩn đoán và theo dõi các bệnh ung thư: bệnh bạch cầu, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư phổi
• chẩn đoán khuynh hướng ung thư: ung thư vú và buồng trứng (gen BRCA1 và BRCA2), ung thư đại trực tràng (gen APC và CHEK2)
• chẩn đoán các bệnh di truyền: bệnh huyết sắc tố (gen HFE), bệnh thalassemia (gen HBA1 và HBA2), bệnh celiac (gen HLA)
• Các xét nghiệm quan hệ cha con, phát hiện sự tương thích DNA của đứa trẻ và người cha

Cũng đọc: Xét nghiệm bệnh Lyme - chúng trông như thế nào và giá của xét nghiệm bệnh Lyme Xét nghiệm Western Blot và bệnh Lyme. Giải thích kết quả xét nghiệm Các bệnh do ve: bệnh Lyme, bệnh lê dạng trùng, bệnh bartonellosis, TBE và các bệnh khác.

Hiện nay, có nhiều sửa đổi đối với phương pháp PCR. Ví dụ, trong chẩn đoán Lyme borreliosis, các phương pháp PCR lồng nhau (nested PCR) và PCR thời gian thực được sử dụng chủ yếu. Phương pháp sau là một phương pháp định lượng và cho phép xác định số lượng chính xác các bản sao DNA của Borrelia trong vật liệu sinh học được thử nghiệm.

PCR (nghiên cứu) và bệnh Lyme

Các xét nghiệm huyết thanh học là cơ sở để chẩn đoán bệnh Lyme. Tuy nhiên, có những tình huống lâm sàng có thể khiến các xét nghiệm này âm tính giả:

• cửa sổ huyết thanh học, tức là thời kỳ nhiễm trùng ban đầu, trong đó cơ thể chưa sản xuất kháng thể IgM và IgG đặc hiệu chống lại xoắn khuẩn Borrelia
• ở những người bị suy giảm miễn dịch không sản xuất đủ kháng thể
• sự hiện diện của các phức hợp miễn dịch bao gồm các kháng nguyên Borrelia và các kháng thể đặc hiệu cho chúng, và ngăn cản việc phát hiện các kháng thể bằng các phương pháp huyết thanh học

Nếu các triệu chứng của bệnh Lyme được nghi ngờ ở bệnh nhân và kết quả xét nghiệm huyết thanh âm tính thì có thể thực hiện các xét nghiệm phân tử dựa trên phương pháp PCR.

DNA của xoắn khuẩn Borrelia có thể được phát hiện trong giai đoạn đầu của sự lây nhiễm, vì số lượng xoắn khuẩn trong dịch cơ thể khi đó là cao nhất.

Trong chẩn đoán bệnh Lyme, các phương pháp huyết thanh học như ELISA chủ yếu được sử dụng, nhưng trong một số tình huống lâm sàng, các xét nghiệm di truyền bằng phương pháp PCR là hữu ích.

Thời gian từ khi lây nhiễm càng lâu, khả năng phát hiện DNA của vi khuẩn càng ít. Vì vậy, trong một số trường hợp, trước khi thực hiện xét nghiệm PCR, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường đặc biệt trong 1-2 tuần và sau đó thực hiện xét nghiệm.

Cách tiếp cận này được sử dụng trong trường hợp nghi ngờ bệnh Lyme và dịch não tủy thu hoạch. Trong giai đoạn muộn của nhiễm trùng, thích hợp hơn là thực hiện xét nghiệm ELISA.

Phương pháp PCR không nên được sử dụng trong chẩn đoán thông thường bệnh Lyme do thiếu tiêu chuẩn liên quan đến sự xuất hiện của các giống Borrelia burgdorferi ở Ba Lan.

Tuy nhiên, trong trường hợp khó chẩn đoán (đặc biệt là trong giai đoạn đầu của bệnh), kết quả của xét nghiệm PCR sẽ giúp ích cho quá trình chẩn đoán.

Kết quả xét nghiệm dương tính có nghĩa là sự hiện diện của DNA Borrelia burgdorferi và các giống của nó đã được phát hiện trong vật liệu thử nghiệm, nhưng nó không giải thích liệu có đang diễn ra nhiễm trùng đang hoạt động trong cơ thể hay không. Mặt khác, một kết quả âm tính không loại trừ sự hiện diện của vi khuẩn trong cơ thể.

Một số phòng thí nghiệm tiến hành xét nghiệm sự hiện diện của DNA Borrelia trong con ve. Tuy nhiên, kết quả của cuộc kiểm tra như vậy không phải là cơ sở để chẩn đoán bệnh Lyme ở người bị cắn.

Đề xuất bài viết:

Kiểm tra ELISA - nó phát hiện những gì? Làm thế nào để đọc kết quả? Giá của bài kiểm tra

PCR - kết quả. Chúng có thể là dương tính giả không?

PCR là một phương pháp siêu nhạy và đồng thời rất nhạy với sự nhiễm bẩn. Vì vậy, điều rất quan trọng trong các xét nghiệm dựa trên PCR là chọn một kiểm soát nội bộ thích hợp để loại trừ dương tính giả.

Điều quan trọng cũng là việc thu thập chính xác tài liệu để kiểm tra cũng như kinh nghiệm và độ tin cậy của chuyên gia chẩn đoán thực hiện kiểm tra.

PCR - kết quả. Chúng có thể là âm tính giả

Như trong bất kỳ xét nghiệm nào trong phòng thí nghiệm, cũng như trong phương pháp PCR, kết quả âm tính giả có thể xuất hiện. Ở đây, điều quan trọng là phải lấy máu để tìm chất chống đông máu thích hợp, vì một số chất trong số đó, chẳng hạn như heparin, có thể ức chế phản ứng PCR.

Ngoài ra, thu thập vật liệu sau khi bắt đầu điều trị bằng kháng sinh có thể làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR và có nhiều khả năng cho kết quả âm tính giả hơn.

Cũng nên nhớ rằng vi khuẩn Borrelia sống một thời gian rất ngắn trong máu và dịch cơ thể, vì nhờ các thụ thể đặc biệt mà chúng xâm nhập rất nhanh vào những nơi “khó tiếp cận” trong cơ thể.

Vì vậy, trái ngược với chẩn đoán của các vi sinh vật khác, số lượng xoắn khuẩn Borrelia trong vật liệu sinh học là ít, thậm chí có khi ở giới hạn phát hiện của phương pháp PCR. Điều này cũng có thể gây ra âm tính giả.

Đề xuất bài viết:

Thử nghiệm chuyển đổi tế bào bạch huyết (LTT)

Văn chương

1. Dunaj J. và cộng sự. Tầm quan trọng của phương pháp PCR trong chẩn đoán bệnh Lyme. Duyệt qua Dịch tễ. 2013, 67, 119 - 123.
2. Phòng thí nghiệm chẩn đoán các bệnh do ve gây ra Khuyến nghị của Nhóm công tác: Phòng Chẩn đoán Phòng thí nghiệm Quốc gia, Viện Y tế Công cộng-Viện Vệ sinh Quốc gia, Chuyên gia tư vấn quốc gia trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, Khoa Truyền nhiễm và Nhiễm trùng thần kinh, Đại học Y Białystok, Hiệp hội Vi rút học Ba Lan, Warsaw 2014.
3. Ružić-Sabljić E. và Cerar T. Tiến bộ trong chẩn đoán phân tử bệnh Lyme. Chuyên gia Rev Mol Diagn. 2017 tháng 1; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Nguyên tắc và ứng dụng của phản ứng chuỗi polymerase trong các lĩnh vực chẩn đoán y tế: tổng quan. Braz J Microbiol. 2009 tháng 1-tháng 3; 40 (1): 1-11.

Giới thiệu về tác giả

Karolina Karabin, MD, PhD, nhà sinh học phân tử, nhà chẩn đoán phòng thí nghiệm, Cambridge Diagnostics Polska Một nhà sinh vật học có chuyên môn về vi sinh và một nhà chẩn đoán phòng thí nghiệm với hơn 10 năm kinh nghiệm trong phòng thí nghiệm. Tốt nghiệp Trường Y học Phân tử và là thành viên của Hiệp hội Di truyền Người Ba Lan. Trưởng nhóm nghiên cứu được cấp bằng tại Phòng thí nghiệm Chẩn đoán Phân tử thuộc Khoa Huyết học, Ung thư và Bệnh nội của Đại học Y Warsaw. Bà đã bảo vệ danh hiệu tiến sĩ khoa học y tế ngành sinh học y học tại Khoa Y 1 của Đại học Y Warszawa. Tác giả của nhiều công trình khoa học đại chúng và khoa học trong lĩnh vực chẩn đoán trong phòng thí nghiệm, sinh học phân tử và dinh dưỡng. Hàng ngày, với tư cách là chuyên gia trong lĩnh vực chẩn đoán trong phòng thí nghiệm, ông điều hành bộ phận chuyên sâu tại Cambridge Diagnostics Polska và hợp tác với một nhóm chuyên gia dinh dưỡng tại CD Dietary Clinic. Anh ấy chia sẻ kiến ​​thức thực tế của mình về chẩn đoán và điều trị bệnh bằng chế độ ăn uống với các bác sĩ chuyên khoa tại các hội nghị, khóa đào tạo và trên các tạp chí và trang web. Cô đặc biệt quan tâm đến ảnh hưởng của lối sống hiện đại đến các quá trình phân tử trong cơ thể.